hNIS转染鼻咽癌介导放射性核素显像和治疗的实验研究

题名:hNIS转染鼻咽癌介导放射性核素显像和治疗的实验研究
作者:钟兴
学位授予单位:暨南大学
关键词:人甲状腺钠/碘同向转运体;;基因转染;;放射性核素显像;;放射性核素治疗;;磁共振成像;;扩散加权成像;;鼻咽癌
摘要:目的：
 本文通过建立基于人甲状腺钠／碘同向转运体(hNIS)基因转染介导放射性核素显像和治疗鼻咽癌的技术,为鼻咽癌进行放射性核素报告基因显像和基因治疗提供一种新的治疗策略；通过建立动物模型,运用扩散加权磁共Rare earth magnets振成像(DW-MRI)早期评价131I对hNIS转染鼻咽癌移植瘤的治疗效果,为靶向放射性核素治疗的疗效监测提供新的方法；以调控肿瘤凋亡的相关基因为靶点,探讨hNIS转染介导放射性核素治疗鼻咽癌的作用机制。
 方法：
 1、体外部分：构建重组表达质粒pCMV-Tag2-hNIS,通过脂质体法转染鼻咽癌细胞株CNE-2,G418筛选得到稳定表达hNIS的鼻咽癌细胞株CNE-2-hNIS;研究其摄取125I活性以及125I内流和外流特征；通过CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、Hoechst 33342荧光染色法和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测131I对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响。
 2、体内部分：建立裸鼠鼻咽癌移植瘤模型。当移植瘤直径达10 mm时,裸鼠腹膜内注射125I,用Y-计数器测定注射后0.5、1、2、6、24小时不同脏器的cpm计数,进行裸鼠体内脏器125I分布定量实验；裸鼠腹腔内注射99mTcO4,进行鼻咽癌荷瘤裸鼠99mTc显像。
 3、运用磁共振成像(MRI)观察131I治疗后实验组和对照组移植瘤在3、6、12、18、24天的体积变化情况；通过DW-MRI观察131I治疗后3、6、12、18、24天移植瘤ADC值的变化,并与治疗后6、12、18、24天TUNEL法和Caspase-3免疫组化法检测细胞凋亡,Ki-67免疫组化法检测细胞增殖情况进行相关性分析。
 4、通过Western blot检测131I作用前后鼻咽癌细胞内p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Survivin的蛋白表达水平的变化。
 结果：
 1、成功构建重组表达质粒pCMV-Tag2-hNIS,得到稳定表达hNIS的鼻咽癌细胞株CNE-2-hNIS。CNE-2-hNIS摄取125I活性较CNE-2增高17.1±2.3倍(P<0.05),125I在CNE-2-hNIS中快速聚集,30分钟达到高峰,同时125I从细胞中亦快速外流,有效半衰期约为8.45分钟。随着131I浓度的增高,CNE-2-hNIS增殖率和克隆形成率逐渐降低,凋亡率逐渐增高。
 2、成功构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,体内脏器125I分布定量实验显示,hNIS转染移植瘤摄取125I能力增强,1小时达到高峰,2小时仍维持较高的水平,125I生物半衰期约1.56小时。99mTc显像实验显示,hNIS转染移植瘤有放射性浓聚,肿瘤显影清晰,而对照组移植瘤未见显影。
 3、通过MRI观察,131I治疗后实验组移植瘤体积较对照组明显缩小(P<0.05)。DW-MRI显示,131I治疗后第3天,实验组ADC值有增高,第6天和12天http://www.chinamagnets.biz/达到高峰,随后ADC值下降,治疗后移植瘤ADC值与TUNEL法检测细胞凋亡率呈正相关(r=0.72,P<0.05),与Caspase-3阳性率呈正相关(r=0.65,P<0.05),与Ki-67标记指数呈负相关(r=-0.71,P<0.05)。
 4、131I作用于hNIS转染的鼻咽癌细胞,上调p53表达,下调Bcl-2表达,Caspase-3活化增加,Survivin蛋白高表达,对Bax的表达无影响。
 结论：
 成功建立基于hNIS基因转染介导放射性核素显像和治疗鼻咽癌的基因治疗方法。首次运用DW-MRI成像技术实现从水分子微观变化水平对靶向放射性核素治疗肿瘤疗效的早期无创性监测,展示了DW-MRI在基因治疗疗效监测上的应用前景。131I能有效抑制hNIS转染鼻咽癌的生长,其凋亡作用机制与上调p53表达,下调Bcl-2表达,促进Caspase-3活化有关。
学位年度:2010

题名:慢性荨麻疹生活质量和临床特征调查及慢性特发性荨麻疹嗜碱性粒细胞相关研究
作者:马一平
学位授予单位:北京协和医学院
关键词:荨麻疹;;生活质量;;问卷;荨麻疹;;临床分析;;慢性荨麻疹;;基因表达;;RNA;;微点阵;慢性荨麻疹;;嗜碱性粒细胞;;AP-1;;慢性荨麻疹;;嗜碱性粒细胞
摘要:慢性荨麻疹(CU)是一类常见的皮肤病,表现为反复出现的红斑、风团伴瘙痒(可合并血管性水肿),持续至少六周以上。因其死亡率极低,治疗药物通常有效,很少伴其他器官或功能损害。故而,临床医生一般认为其病情严重度较低,不影响患者生活。但近来有学者总结众多CU患者生活质量的相关研究,发现该病对患者生活质量的影响与一些心脏病等致死性疾病,及诸如银屑病、特应性皮炎等明确影响患者生活质量的皮肤疾病相似或较之更为严重。可见,评估某种疾病的严重性,不仅应看到其躯体疾病严重性,也应考虑到该病对患者自身生活质量的影响。因此我们本研究中首先通过WHOQOL-BREF量表对我国CU患者生活质量进行分析研究。
 另有研究表明,由于东西方人群之间存在一定的免疫遗传学、饮食习惯和社会经济状况的差异,从而导致CU患者在不同人群之间临床表现与实验室检查方面的一些差异。目前,国内关于CU发病特点、病程、预后等的回顾研究不多,对其了解的仍不够,为了从临床上获得更多的资料信息,进而指导实验室的深入研究,故而我们对310例CU患者进行回顾性分析。
 目前认为,近一半CU患者体内存在抗FcεRI抗体和抗IgE自身抗体,应归属为自身免疫性荨麻疹(CAU)。而其他大部分CU患者发病原因尚不完全明了归属为慢性特发性荨麻疹(CIU)。CIU是一种常见的皮肤病,在美国,其患病率大约为1%,保守估计我国目前至少有上千万的该病患者。该病的平均病程为3至5年,20%的CIU患者病程超过5年。有研究表明,CIU患者的生活质量受损与心脏病患者和诸如特应性皮炎、银屑病等皮肤病相似。在美国,教学医院就诊的CIU患者(不使用免疫抑制剂者),每年的医疗花费平均超过2000美元,因而有必要深入研究该病发病机制和治疗方法,提高治疗效果。
 众多研究支持肥大细胞和嗜碱性粒细胞在CIU发病中发挥作用。曾经认为,嗜碱性粒细胞也许是循环的前体肥大细胞或肥大细胞是“组织内的嗜碱性粒细胞”。但目前的证据表明,成熟的嗜碱性粒细胞是终末分化的循环的粒细胞,在许多炎症反应或免疫过程中能浸润组织或出现在渗出物中,是正常人血液中组胺的主要来源。相反,形态学上已成熟的肥大细胞不能循环,而是在其所在的血管化组织内发育成熟。基于近年来特殊细胞系、单克隆抗体及高纯度细胞分选技术的应用,发现嗜碱性粒细胞在过敏性反应和免疫调节中具有人们不曾认识到的重要功能。CU患者嗜碱性粒细胞具有一些区别于健康人群和异位性疾病患者的特征。
 鉴于此,我们选择嗜碱性粒细胞为研究对象,首先采用DNA微阵列技术,进行CIU患者嗜碱性粒细胞差异表达基因的研究。通过筛选CIU相关的差异表达基因,构建CIU患者嗜碱性粒细胞差异表达基因文库,从而为探索CIU的发病机制寻找线索。研究结果发现,CIU患者与健康对照组相比,存在差异表达基因共计30个。其中表达上调基因12个,表达下调基因8个,功能不明基因10个。这些差异表达基因大多数为参与细胞内信号转导的基因,涉及到的信号转导途径包括MAPK信号转导途径、Toll样受体信号转导途径、T细胞和B细胞信号转导途径。在这些信号途径中,转录激活蛋白1(AP-1)蛋白分子基因(Jun和Fos)的低表达尤为突出。
 基因的表达方式错综复杂,同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用,生命活动的真正执行体是蛋白质。结合以往有研究在一些变应性疾病中发现AP-1蛋白高表达,本研究中,我们分别通过蛋白免疫印迹(WB)法和TransAMTM AP-1试剂盒对c-jun、c-Fos、p-c-jun等蛋白表达情况和AP-1家族因子DNA结合活性进行检测。结果发现CIU患者嗜碱性粒细胞P-c-jun(Ser73)蛋白表达升高,另存在AP-1家族部分因子DNA结合活性的改变,而这些差异可能为CIU的发病机制之一。
 第一部分WHOQOL-BREF量表用于慢性荨麻疹患者生活质量的评价及影响因素分析
 目的评价WHOQOL-BREF中文版用于我国CU患者的生活质量的可行性、信度和效度,并探讨其影响因素。方法：用WHOQOL-BREF和皮肤病生活质量指标(DLQI)分别对210名CU患者进行问卷调查,对210例CU患者一般情况、临床特征及生活质量进行评估。用SPSS软件进行信度、效度分析。对不同分型患者各个领域的生活质量得分进行方差分析,并对各领域得分与可能的影响因素进行相关分析和多元逐步回归分析。结果WHOQOL-BREF用于评价CU患者生存质量的分半信度为0.768,Cronbach'α系数为0.798,且与皮肤病生活质量指标(DLQI)相关程度较高,具有较好的信度与效度。CU患者生活质量得分普遍较低。影响患者生活质量的主要因素有家庭摩擦、食欲、自评分、视觉模拟评分、皮肤科症状评分等。结论WHOQOL-BREF可用于CU患者生活质量的评价,且具有较好的信度和效度。CU患者生活质量偏低,影响患者生活质量的主要因素有家庭摩擦、食欲、自评分、视觉模拟评分、皮肤科症状评分等,改善患者的家庭关系和食欲等有助于患者生活质量的提高。
 第二部分慢性荨麻疹临床表http://www.chinamagnets.biz/现分析
 目的分析慢性荨麻疹(CU)的临床特点、病因、治疗及预后等。方法对两年内就诊的310例CU患者进行回顾性分析。结果慢性持续性荨麻疹最为常见,占全部患者的53.9%。310例CU患者男女比例为1.08：1；合并血管性水肿者40例；物理性荨麻疹58例；18例患者可能存在感染因素；ANA阳性率高达18.0%；HP的感染率为26.2%；其他可能的病因包括食物、药物、异位性体质、结缔组织疾病等。36.1%的患者皮疹晚上发作；11.6%的患者皮疹发作存在一定的季节性；6.8%的患者具有荨麻疹疾病家族史。大部分患者抗组胺药物治疗有效。结论经过详细的病史分析和一定的实验室检查,有51%的患者找到了可能的原因,对治疗有帮助。认真详尽的病史询问和体格检查仍然是很有效的协助治疗的诊断工具。
 第三部分慢性特发性荨麻疹患者嗜碱性粒细胞差异表达基因的研究
 目的研究健康人及慢性特发性荨麻疹(CIU)患者外周血嗜碱性粒细胞基因表达谱,分析CIU患者嗜碱性粒细胞基因表达水平的变化。方法分离提取2例CIU患者和2名健康人的外周血嗜碱性粒细胞,提取总RNA；利用cRNA标记方法对样品进行荧光标记,纯化后吹干,然后用于芯片杂交；用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行芯片扫描；采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因。结果存在差异表达基因共计30个。其中表达上调基因12个,表达下调基因8个,功能不明基因10个。这些差异表达基因大多数为参与细胞内信号转导的基因,涉及到的信号转导途径包括MAPK信号转导途径、Toll样受体信号转导途径、和T细胞和B细胞信号转导途径。结论CIU患者嗜碱性粒细胞的一些基因表达水平与正常人存在差异,这些基因差异表达是否与CIU发病有关,有必要做进一步的研究。
 第四部分慢性特发性荨麻疹患者外周血嗜碱性粒细胞c-jun、c-Fos蛋白表达研究
 目的检测慢性特发性荨麻疹患者嗜碱性粒细胞c-jun、c-fos蛋白表达情况。探讨这些蛋白与疾病的可能关系。方法采用嗜碱性粒细胞免疫磁珠分离技术、核／浆蛋白分离法,分离CIU患者外周血嗜碱性粒细胞核蛋白,与健康人对照进行比较,进一步通过蛋白免疫印迹法检测c-jun、c-Fos、p-c-jun蛋白表达情况。结果CIU患者组与健康对照组相比较,c-jun、c-Fos、P-c-jun(Ser76)蛋白表达无明显差异。CIU患者组P-c-jun(Ser73)蛋白表达高于健康对照组。结论CIU患者嗜碱性粒细胞P-c-jun(Ser73)蛋白表达升高可能为CIU的发病机制中的一个环节。
 第五部分慢性特发性荨麻疹患者嗜碱性粒细胞转录激活蛋白-1DNA结合活性的研究
 目的探讨转录激活蛋白1(AP-1)在慢性特发性荨麻疹(CIU)发病中的作用。方法采用嗜碱性粒细胞免疫磁珠分离技术、核／浆蛋白分离法、TransAMTM AP.1试剂盒等,研究CIU患者血中嗜碱性粒细胞AP-1家族因子DNA结合活性的改变。结果CIU患者组Phospho-c-jun、c-fos、Fos-B、Jun-B、Jun-D因子DNA结合活性高于正常对照组,其中Phospho-c-jun、c-fos差异有显著统计学意义。Fra-1因子DNA结合活性检测中,CIU患者组低于正常对照组。结论CIU患者嗜碱性粒细胞AP-1家族部分因子DNA结合活性的改变,可能为CIU发病环节之一。
学位年度:2010